En la web de Ampligen ya hemos hablado varias veces sobre las distintas formas de recoger una muestra a la hora de realizar una prueba de ADN. Sin embargo, en este artículo queremos profundizar sobre las distintas técnicas a las que suelen recurrirse a la hora de realizar el análisis de dicho ADN.
Obtención del ADN
En primer lugar, una vez obtenida la muestra a través de diferentes métodos, se deberá obtener el ADN de ellas. Existen diversos procedimientos.
Kits para purificar el ADN
A lo mejor ya has oído hablar sobre los kits para purificar el ADN, de los que existe una amplísima variedad en el mercado. Esta fórmula suele ser cara, con protocolos bastante tediosos y, sobre todo, suelen contener reactivos realmente tóxicos (como pueden serlo el cloroformo o la guanidina).
Lisis Alcalina para extraer el ADN
Si buscamos una alternativa mucho más económica y eficaz, nos encontraremos con el método de extracción por Lisis Alcalina, método especialmente rápido.
Suele llevar unos 10 minutos donde se introducen las muestras en un tubo con sosa y se somete a altas temperaturas. Con ello, rompen las membranas, liberando todo el contenido celular (donde se incluye el ADN). Después, se pasará lo resultante por un ácido, neutralizándolo.
Con este proceso, ya se puede analizar o congelar para la conservación del ADN.
Ahora bien, no es un método de purificación de ADN (como ocurría con los kits comerciales anteriores). Se trata únicamente de un método de extracción por el que se obtiene un extracto de ADN junto con otros restos celulares, lípidos, aminoácidos, etc.
A pesar de que pueda parecer que si el ADN no se purifica, pudiera no analizarse bien, la calidad de este método es compatible con las técnicas que suelen utilizarse para un análisis profesional del ADN.
Amplificación del ADN
Para analizar el ADN, tras extraerlo o purificarlo, deberemos contar con algún método de amplificación.
La amplificación (o clonación acelular) consiste en copiar varias veces un fragmento de ADN para poder analizar algún aspecto del mismo o poder comprobar alteraciones o la presencia de determinados genes.
Daremos dos pasos para poder realizar esta amplificación del ADN.
Primer paso: el diseño de cebadores
Para analizar cualquier marcador genético, necesitaremos el diseño de una pareja de oligonucleótidos (también llamados cebadores, primer o iniciadores). Estos cebadores servirán como punto de partida para poder replicar el ADN y será lo que utilicemos en la PCR.
Segundo paso: reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Los cebadores se utilizarán en la PCR para poder obtener varias copias de la región que queremos analizar. En este paso, las cadenas de ADN se separarán y los cebadores se unirán. Esto dará lugar al conocido Amplicón.
Aunque es una técnica muy utilizada, es muy fácil de contaminar debido a esa amplificación que se realiza.
Análisis del ADN, tras la amplificación
Una vez conseguidas las muestras, obtenido el ADN y amplificado, podremos dar lugar al último paso: analizarlo. Existen varias técnicas de análisis de ADN, las más comunes son:
La electroforesis
Esta técnica consiste en separar fragmentos de ADN, ARN, moléculas o proteínas según su tamaño. Para ello, se utilizan corrientes eléctricas sobre los productos obtenidos de la PCR que mueven las moléculas, separándolas por grandes o pequeñas.
Tiene numerosas aplicaciones como, por ejemplo, en la medicina forense.
La secuenciación
Se trata de una técnica estándar por ser la más exacta, ya que es capaz de leer la secuencia del mencionado Amplicón. Con la secuenciación, se puede analizar cualquier tipo de mutación.
La PCR a tiempo real o cuantitativa
Quizá sea la técnica más utilizada. Se trata de una PCR convencional a la que se le añade un compuesto fluorescente.
Básicamente, te permite controlar el avance de la PCR conforme se va produciendo.
Esta técnica permite realizar el análisis en el mismo tubo en el que se ha realizado la amplificación (lo que se conoce como ensayo homogéneo). Al no tener que manipular el Amplicón en ningún momento, se reduce significativamente el riesgo de contaminación.
Texto revisado por la Doctora Pilar Arca Miguélez, Responsable Científica de Ampligen
