Cómo se hace una prueba de ADN de paternidad

Qué tipos de pruebas de ADN de paternidad puedes solicitar

La forma de hacer un estudio de estas características es muy sencilla, dependerá del uso que se le quiera dar. No es lo mismo necesitar una prueba para tu propio conocimiento e información personal, que necesitarla para poder utilizar el resultado de la misma, en un procedimiento judicial.

Prueba privada, personal o confidencial

Se hará cuando así lo quiera el solicitante y no se podrá utilizar en un procedimiento legal. En este tipo de pruebas ni siquiera es necesario que en el informe consten los nombres de las personas que han sido analizadas.

Prueba legal, para uso judicial u otros

Es cuando el solicitante necesita que se acredite de forma completa que personas han sido sometidas al análisis, y poder así aportar el informe en un procedimiento legal (generalmente judicial). Para ello es imprescindible garantizar la cadena de custodia desde la toma de las muestras hasta la emisión del informe por el laboratorio.

La toma de las muestras a analizar solo puede ser realizada por profesionales que identificarán las mismas y certificarán la identidad de las personas a las que se les han tomado y procederán a su custodia para garantizar en todo momento su autenticidad e integridad.

Aunque no existen datos oficiales a nivel nacional sobre estadísticas de este tipo de pruebas, las pruebas privadas suelen ser las más solicitadas por la facilidad del proceso y su precio. Concretamente, las pruebas legales en Ampligen suponen aproximadamente el 35% de las pruebas que realizamos.

Cómo se hace una prueba de ADN

Es una pregunta que frecuentemente nos realizan ¿Cómo se hace una prueba de paternidad?

Esa pregunta puede encerrar muchas respuestas, ya que la gente engloba en el concepto de prueba de paternidad, otras muchas pruebas biológicas que se usan para establecer otro tipo de relaciones, no solamente las paternidades. Ciñéndonos a las de paternidad lo fundamental es poder disponer de muestras del presunto padre y de su hijo. La muestra de la madre no es necesaria para establecer la relación de paternidad.

Habitualmente las muestras a analizar se obtienen directamente de la saliva de las personas a analizar, mediante un frotis bucal realizado con bastoncillos de algodón que se introduce en la boca y frotas por el interior de la mejilla.

También se puede obtener ADN de otros muchos tipos de muestras:

• Uñas cortadas (de manos o pies).
• Pelos arrancados, con raíz o bulbo (los pelos cortados no sirven).
• Colillas, cepillos de dientes, chicles, caramelos y similares.
• Manchas de sangre (tiritas), de semen (preservativos) o de sudor (ropa sin lavar).
• Objetos con saliva: recipientes de bebidas (vasos, latas, tazas), sobres o sellos.
• Pañuelos con mucosidades.
• Dientes de leche, pinzas de ombligo y cordones umbilicales.
• Orina (pañales).
• Restos cadavéricos (huesos y dientes).
• Tejidos biológicos (biopsias en parafina).

La muestra recomendada siempre será la de sangre o – por la sencillez en su obtención – la de saliva, obtenida a través del frotis bucal mencionado. Son las muestras más utilizadas y de las que se obtendrán resultados con bastante exactitud.

En el caso de no poder acceder a este tipo de muestras por el motivo que sea, siempre se podrán llevar otro tipo de objetos como los anteriormente especificados. Si fuera el caso, es importante utilizar guantes limpios a la hora de recogerlos para evitar contaminaciones y permitir que se pueda extraer el ADN correcto del objeto a analizar. También sería altamente recomendable el uso de mascarilla y evitar que el objeto entre en contacto con nuestra ropa u otra superficie que pudiera contaminar la muestra, dificultando la obtención del ADN en el mismo.

Una vez recogida la muestra, se deberá aislar y proteger lo antes posible, introduciéndola en una bolsa o contenedor limpio y desechable (de un solo uso para evitar que pudiera haber restos que contaminen la muestra).

Por norma general, no hará falta conservar la muestra a ninguna temperatura una vez tomada. Lo que sí será aconsejable es enviar lo antes posible al laboratorio el objeto o sustancia a analizar, para minimizar el riesgo de contaminaciones.

Las pruebas de paternidad realizadas con ADN son muy precisas, y su fiabilidad es muy alta. Se puede llegar a determinar la relación de paternidad con porcentajes mayores del 99.999%. Este porcentaje aumentará en función de dos factores, el número de marcadores de ADN que se analicen y de la frecuencia que sus valores presenten en el conjunto de la población.

Tenemos una sección específica sobre dudas sobre pruebas de paternidad donde respondemos a las preguntas más frecuentes y también te puedes informar a la hora de solicitar una prueba de ADN con Ampligen.

En Ampligen contamos con más de 20 años de experiencia en análisis genéticos y estudios de ADN

¿Cómo prepararse para un test de ADN?

Cuando se realiza un test de paternidad, suele existir una duda razonable por alguna de las partes involucradas de que el presunto padre sea realmente el padre biológico. Es importante ser conscientes de las implicaciones que podrían tener los resultados si se obtienen unos que no se esperaban. No sólo en términos legales (por la custodia del menor, la pensión, herencia, etc.) sino por los cambios en la vida de las personas involucradas, especialmente si existen vínculos afectivos entre el padre e hijo.

Por poner un escenario de ejemplo, podría darse el caso de que el presunto padre no fuera el padre biológico. Podría querer seguir implicándose con el que creyó que era su hijo y seguir manteniendo la relación con él, lo que podría chocar con los intereses de otras partes involucradas en la ecuación. En otras palabras, se trata de una situación compleja que no todo el mundo podría estar preparado a nivel emocional para asumir si el resultado no es el esperado.

Por ello, en muchos países del mundo, existen restricciones a la hora de acceder a este tipo de pruebas con la premisa de proteger al menor. Es decir, si el padre supiera que no lo es realmente y decidiera dejar de pagarle la manutención, esto concluiría con un empeoramiento de las condiciones de vida del hijo. Para proteger la situación económica el menor, en muchos países (incluidos algunos de Europa) introducen una serie de barreras y restricciones con ciertos casos donde hay dudas sobre la paternidad.

Ante todo, debido a la complejidad de estas situaciones, es importante hablar con las partes involucradas antes de acceder al proceso. Establecer unas pautas y expresar cómo les gustaría vivir o comportarse en los distintos escenarios, dependiendo de los resultados de la prueba.

¿Qué tecnología se usa para analizar el ADN?

En 1985 Alec Jeffreys utilizó, por primera vez, el ADN para la identificación humana, para lo que utilizó un patrón de bandas, similar a los códigos de barras, y que denominó huella digital del ADN (DNA fingerprinting). Hoy en día a esa prueba se la conoce como perfil de ADN, huella genética o prueba de ADN. Este perfil es, en la práctica, único e irrepetible, si no incluimos a los gemelos monocigotos; lo que en la práctica nos permite diferenciar una persona de otra y establecer sus relaciones biológicas de parentesco.

Las aplicaciones de las pruebas de ADN son muy diversas, pero destacan dos: las pruebas de paternidad que resuelven conflictos de filiación, y las pruebas forenses, utilizadas en la resolución de casos criminales para establecer la relación de un sospechoso con las evidencias biológicas obtenidas en la escena de un crimen, para incriminarle o, en su caso, exonerarle.

También se utilizan para establecer las relaciones familiares e identificar a personas a partir de sus restos en caso de desastres o desapariciones.

También han servido en investigaciones históricas (por ejemplo los restos de los Zares rusos y su familia, o el origen de Cristobal Colón), y otros muchos estudios sobre migraciones, arqueología o paleontología.

Allí donde se pretenda establecer una relación biológica entre personas, por el motivo que fuese, la tecnología del ADN nos permitirá acreditarla de forma científica.

En los estudios antropológicos se utiliza el ADN para establecer el origen, evolución y migraciones de grupos humanos.

Nosotros nos centraremos en las pruebas de paternidad, revisando algunos aspectos del genoma humano, los marcadores moleculares, las técnicas utilizadas para obtener el perfil de ADN, y como se interpretan los resultados de los informes de laboratorio, y otras cuestiones habituales en las pruebas de ADN.

Genoma y Marcadores moleculares

La composición del ADN es perfectamente conocida: una doble hélice que gira sobre sí misma y que contiene información codificada por cuatro moléculas o nucleótidos: A, G, C y T (adenina, guanina, citosina y timina). El ADN es importante porque su información es imprescindible en el funcionamiento celular, contiene las instrucciones necesarias para la síntesis de las proteínas encargadas de realizar las diferentes funciones celulares, ya sea en forma de enzimas, hormonas, receptores, etc.

Cada uno de nuestros padres nos aporta la mitad de nuestro material genético. Dicho material genético está en el núcleo de todas nuestras células, por lo que, al menos en teoría, es factible realizar una prueba de ADN a partir de cualquier tejido de nuestro cuerpo.

Aunque el genoma completo de una persona contiene 6.400 millones de nucleótidos solo una pequeña parte se “expresa” para formar proteínas (menos del 5%); a los fragmentos del genoma con una secuencia de nucleótidos que sirven para formar una proteína se les denomina genes.

Dado el gran número de nucleótidos que contiene el genoma, es evidente que tiene un gran potencial en las tareas de identificación de personas. De hecho las pruebas paternidad mediante ADN consisten en el análisis de secuencias altamente variables de ese genoma en las que los individuos de una población pueden tener formas diferentes a las que se denominan alelos.

Estas secuencias al ser heredadas de nuestros padres, también pueden ser utilizadas para establecer relaciones de parentesco, por lo que se les conoce como marcadores genéticos o marcadores moleculares. Cabe señalar que para cada marcador una persona tendrá dos alelos, uno heredado de su madre y el otro de su padre; la combinación de alelos que recibimos de nuestros padres recibe el nombre de genotipo.

En concreto las secuencias o marcadores que utilizaremos para realizar una prueba de paternidad mediante ADN tienen como particularidad el tener repeticiones cortas en tandem denominadas STRs (short tandem repeats) o microsatélites. En el genoma de cualquier persona hay miles de STRs que pueden ser utilizados como marcadores moleculares.

Los STRs se componen de secuencias cortas repetidas, por ejemplo AATT, formando alelos que se nombran por el número de veces que se encuentre la secuencia repetida: así por ejemplo, el alelo 8 tendrá ocho veces esta secuencia (AATTAATTAATTAATTAATTAATTAATTAATT).

En una población pueden existir varios alelos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, etc. El par de alelos o genotipo de una persona para cada marcador STR (por ejemplo 8/9), permite diferenciarlo o establecer su relación con otras personas. Cuando los dos alelos de un marcador son diferentes se dice que su genotipo es heterocigoto; mientras cuando las repeticiones son las mismas en ambos alelos se dice que su genotipo es homocigoto para el STR en cuestión.

Un hombre y una mujer que sean heterocigotos para un marcador determinado, podrían trasmitir a su hijo cuatro combinaciones diferentes, esta circunstancia nos permite diferenciar entre personas estrechamente relacionados. Un perfil de ADN, también llamado huella genética se genera obteniendo los genotipos de varios STRs, lo que da lugar a un código que presumiblemente puede llegar a ser único e irrepetible (9/9, 11/13, 16/22, 21/27, etc). Hay que señalar que el rango de alelos de cada STR puede ser diferente, por ejemplo, para un marcador dado los alelos pueden ir del 8 al 13, mientras para otro marcador las repeticiones van del 11 al 30.

Aspectos técnicos

La forma en que vamos a obtener un perfil de ADN se basa en obtener millones de copias de esas secuencias del genoma que nos permiten distinguir a las personas, los marcadores STRs. La técnica que utilizamos nos permite copiar el ADN in vitroy se conoce por sus siglas PCR (reacción en cadena de la polimerasa).

La PCR consiste en calentar, durante varios ciclos, el ADN obtenido de las muestras y el proceso sigue los siguientes pasos, en cada ciclo:

• Desnaturalización, el calor abre la cadena del ADN,
• Alineamiento de secuencias cortas conocidas como primers, que delimitan las regiones que se van a replicar, y
• Extensión, formándose cadenas nuevas de ADN por acción de la Taq polimerasa, una enzima termoestable capaz de añadir nucleótidos a los extremos de los primers.

En cada ciclo del PCR se duplica la secuencia de interés (STRs), por lo que en solo 25 ciclos teóricamente tendríamos millones de copias, de lo que se conoce como producto amplificado, y que facilitará análisis posterior.

Para el análisis post-PCR tenemos que recordar que los alelos STRs se diferencian por el número de veces que se repite una secuencia, esto significa que el tamaño o longitud va a ser diferente de un alelo de otro.

Para poder visualizar estas diferencias se utiliza la técnica de la electroforesis, técnica que permite que separemos moléculas en un gel por acción de un campo eléctrico en base a la carga y tamaño de la molécula; las moléculas más pequeñas corren más rápido, mientras las grandes se van retrasando.

Para ello a la vez se han colocado en el gel fragmentos cuyo tamaño conocemos, también llamados marcadores de peso molecular o estándar de tamaño, y/o una mezcla de los diferentes alelos posibles para los STRs que se están analizando, y que se conoce como ladder, con lo que resulta relativamente sencillo definir los alelos/genotipos.

La electroforesis en una prueba de ADN se ha realizado de dos formas: 1) por geles verticales de poliacrilamida, técnica que ya casi no se usa, y 2) electroforesis capilar (EC), cuyo proceso es más preciso y automatizado, por lo que constituye el método más utilizado por los laboratorios de genética forense.

Por último, para ver el ADN amplificado (STRs) y sometido a electroforesis es necesario teñirlo; existen métodos tradicionales como la tinción con nitrato de plata de los geles de poliacrilamida, o más sofisticados que involucran la detección de fluorescencia añadida durante la PCR y que se detecta en sistemas automatizados de electroforesis capilar.

Interpretación de los resultados

Una vez que hemos obtenido los perfiles (en Ampligen les llamamos los DIG – documentos de identidad genética) realizaremos una comparación de los ADNs obtenidos para determinar la relación entre un supuesto padre y un hijo en disputa. Podemos tener dos resultados posibles al comparar sus perfiles:
Qué en al menos dos marcadores no exista ninguna coincidencia entre los alelos/genotipos del supuesto padre e hijo, lo que llamamos exclusión, y descarta de inmediato la paternidad biológica.

Que sí coincida el padre con el hijo en al menos un alelo en todos los marcadores analizados, lo que se interpretará como que el supuesto padre es el padre biológico del hijo en disputa. Pero ojo, antes de llegar a esta conclusión debemos realizar una valoración bioestadística del caso que nos permita contestar la siguiente pregunta: ¿qué tan probable es que el perfil de ADN de cualquier persona, que NO sea el padre biológico, hubiera coincidido por azar o casualidad con el perfil de ADN del hijo en disputa?

Para hacer esta valoración es necesario conocer con que frecuencia se presentan en la población los alelos que concuerdan entre el supuesto padre e hijo. Para entender la importancia de estos datos poblacionales en la interpretación de una prueba de paternidad pondremos un ejemplo: supongamos que en una prueba de paternidad el alelo coincidente entre el supuesto padre e hijo lo tienen también el 95% de las personas de la población (por ejemplo española), ¿podemos pensar que esta sería una prueba contundente de la paternidad?, evidentemente no, es mas lo consideraríamos una evidencia muy débil que no permitiría establecer conclusiones, ya que la mayoría de los varones podrían coincidir con el hijo.

Al contrario, si el alelo concordante entre el supuesto padre y el hijo es muy infrecuente y solo aparece en 1 de cada 10000 personas, la evidencia sería valiosa para establecer la paternidad, ya que sería muy poco probable que hubiera coincidido con el hijo en el caso de que no fuese el padre realmente.

Las frecuencias de alelos en las poblaciones se obtienen de estudios realizados en el territorio donde se van a realizar las pruebas de ADN y, lo ideal es que preferentemente, hayan sido publicadas en revistas científicas serias. En España y otros muchos países ya se dispone de varios estudios que permiten hacer esta valoración.

¿Cuántos marcadores vamos a necesitar para hacer la prueba?

Últimamente se observa, entre las ofertas de pruebas de paternidad que realizan algunas empresas, la utilización de 16 marcadores y versiones “premium” con 22 marcadores, estableciendo una presunta relación de “mas calidad” en función del número de marcadores utilizados. En nuestra opinión esto es una estrategia de marketing para inducir la contratación de pruebas mas costosas, ya que con 16 marcadores es mas que suficiente, y solo casos muy complejos obligan a utilizar un mayor número. De hecho si disponemos de la muestra de la madre, a menudo, se necesitarían menos aún.

El FBI, entre otros organismos, utiliza 13 STRs para la identificación genética humana que constituyen el CODIS, los cuales son suficientes para resolver la mayoría de los casos de paternidad, pero tienen mayor poder de discriminación los que recomiendan organismos europeos.

Sin embargo, en realidad el número de marcadores depende de cada caso, pudiendo ser menor o mayor a 13 marcadores; en realidad lo importante es llegar a una conclusión lo suficientemente confiable. Y, ¿cuándo es suficientemente confiable?, pues es subjetivo.

Hasta hace pocos años se empleaban algunos enunciados para interpretar el porcentaje de paternidad (W); los más famosos son los postulados de Hummel, donde W>99,73% (equivalente a un IP de 400) se traducía como “paternidad prácticamente probada” y era límite máximo para valorar W. El desarrollo científico tecnológico hace que estos enunciados se mantengan, pero como esos valores se consideren obsoletos e insuficientes se ha ido aumentando en todos los laboratorios ese W.

Actualmente entre los laboratorios hay dos tendencias: 1) reportar el valor de W o IP obtenido a partir del sistema genético ofertado o 2) fijar un límite mínimo, por ejemplo de 1.000 o hasta 10.000 para el IP. en caso de no llegar al límite mínimo establecido se procedería a incrementar el número de marcadores analizados, hasta alcanzar una exclusión clara o un valor aceptable de IP.

Para más información

Si tienes dudas de este tipo acude a un centro especializado, como Ampligen y ellos te informarán de todos los métodos y vías existentes sin ningún tipo de compromiso.

Texto revisado por la Doctora Pilar Arca Miguélez, Responsable Científica de Ampligen