A raíz de la pandemia mundial de la COVID- 19 se han popularizado las conocidas pruebas PCR o, lo que es lo mismo, la reacción en cadena de la polimerasa. Pero lo cierto es que el uso de este tipo de pruebas en un laboratorio es habitual desde hace muchísimos años.
Sus usos van desde la creación de perfiles de ADN forense a partir de muestras genéticas, hasta la identificación de patógenos o la secuenciación del ADN.
A lo largo de este artículo explicaremos en qué consiste exactamente esta prueba y sus principales usos.
¿Qué es la reacción en cadena de la polimerasa?
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) fue diseñada por el Premio Nobel de Química Kary Mullis en los años 80 y supuso una gran revolución en la biología molecular.
Sin embargo, aunque se lleva utilizando cada día en miles de laboratorios de todo el mundo, no ha sido hasta la llegada de la pandemia mundial de la COVID-19 cuando su uso se ha popularizado y extendido.
La prueba nació de la dificultad de estudiar trozos de ADN aislados en análisis que requieren grandes cantidades de material genético. Gracias a la prueba PCR es posible copiar una pequeña cantidad de ADN millones de veces de modo que haya suficiente para analizarlo en un laboratorio.
Elementos básicos para realizar una prueba PCR
Para poder realizar la reacción en cadena de la polimerasa es necesario contar con algunos elementos:
ADN molde
Es el fragmento de ADN que queremos amplificar mediante la PCR.
Desoxirribonucleótidos-trifosfato
El ADN está compuesto por 4 tipos de nucleótidos que a su vez están formados por 4 bases nitrogenadas (adenina, guanina, citosina y timina).
Esos 4 desoxirribonucleótidos-trifosfato son indispensables para poder obtener nuevas moléculas de ADN.
Cebadores o primers
Los cebadores son pequeñas secuencias cortas de ADN que se unen a la molécula de ADN molde y sirven como punto de inicio para comenzar la síntesis de ADN.
En la PCR se necesitan dos cebadores.
ADN polimerasas
Aunque en la PCR se pueden utilizar diferentes ADN polimerasas, la más utilizada es la ADN polimerasa de la bacteria Thermus aquaticus, también llamada Polimerasa Taq.
Por su efectividad y resistencia a las altas temperaturas es la más idónea para este tipo de proceso.
Iones divalentes de magnesio
En la PCR se utilizan iones de carga positiva como cofactores de la polimerasa.
Solución tampón
Una solución tampón es una disolución que es capaz de regular el pH de la PCR. Es importante tenerlo en cuenta dado que los cambios en el pH de la disolución pueden alterar los resultados de la prueba.
Además, en la prueba PCR es importante poder regular las condiciones de temperatura. Para ello se utiliza el termociclador.
¿Cómo se realiza la prueba?
La reacción en cadena de la polimerasa o PCR tiene varios ciclos, que se repiten una media de 30 veces dependiendo de la cantidad de muestra que necesitemos.
En primer lugar se debe seleccionar la parte del genoma para amplificar utilizando secuencias cortas de ADN (también conocidas como cebadores) y posteriormente duplicar la secuencia del ADN, aumentando y disminuyendo la temperatura de la muestra seleccionada.
Los cebadores son pequeñas secuencias de ADN diseñados para complementar secciones cortas de este ADN en cada extremo de la secuencia a copiar. Son el punto de partida para sintetizar el ADN.
Las tres etapas de una prueba PCR son:
Desnaturalización del ADN
Esta primera fase suele tardar entre 15 y 30 segundos y es el momento en el que el ADN de doble cadena se calienta para separarlo en dos cadenas simples.
Para ello, es necesario calentarlos a 94-95°C, logrando que los enlaces de hidrógeno se rompan y las dos cadenas se separen. Habrá que mantener la temperatura el tiempo suficiente para garantizar que las dos cadenas se hayan separado por completo.
Alineación del ADN
Dura entre 10 y 30 segundos. Durante esta segunda etapa es importante bajar la temperatura a 50-65°C para permitir que los cebadores (secuencias cortas de ADN) se adhieran a la plantilla de ADN.
Ampliación del ADN
Durante la tercera fase, y paso final de la prueba, se ajusta la temperatura de la solución de nuevo para que la ADN polimerasa pueda actuar a partir de los cebadores.
En este caso la temperatura aumenta a 72ºC y la nueva cadena de ADN es producida por la enzima polimerasa Taq.
El resultado es una nueva cadena de ADN y una molécula de ADN de doble cadena.
Este último paso puede tardar alrededor de un minuto, aunque esto depende de la longitud de la secuencia de ADN que se va a amplificar.
Una vez se ha realizado un ciclo siguiendo estos pasos, se vuelve a empezar de nuevo. De este modo, las cadenas obtenidas en el primer ciclo se utilizan como molde en el segundo ciclo, las obtenidas en el segundo se usan como molde en el tercero y así sucesivamente.
Usos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Aunque el uso más conocido actualmente sea para la detección de la COVID- 19, lo cierto es que la reacción en cadena de la polimerasa lleva usándose muchísimo tiempo en procedimientos de laboratorio diferentes.
Algunas de las más habituales son las pruebas de paternidad o análisis forenses, la detección de microorganismos (bacterias como Salmonella o Listeria o virus como el sida, la hepatitis o el COVID-19) o en el diagnóstico de trastornos genéticos.
Ventajas de la reacción en cadena de la polimerasa
La reacción en cadena de la polimerasa ha aportado muchas ventajas significativas respecto a otros métodos más tradicionales como las pruebas de cultivo.
Algunas de las ventajas más destacadas son:
Rapidez en la respuesta
La reacción en cadena de la polimerasa tarda tan sólo unas horas en arrojar resultados mientras que las pruebas de cultivo bacteriano pueden tardar varios días.
Sensibilidad
La PCR es capaz de detectar organismos en unos niveles muy bajos que serían casi imposibles de cultivar. Esto ayuda a reducir falsos negativos al no disponer de cantidad suficiente para analizar la muestra.
Texto revisado por la Doctora Pilar Arca Miguélez, Responsable Científica de Ampligen
